實時熒光定量PCR的原理及應用

實時熒光定量PCR 可根據熒光染料的不同分為染料法和 TaqMan探針法兩種；而根據數據分析方式又可以分為相對定量和絕對定量。這些不同的實驗方法有不同的原理及應用。

1 SYBR-Green染料法：指在PCR反應體係中，加入熒光染料（SYBR-Green最為常用），進而監測熒光變化的實驗方法。熒光染料SYBR-Green在遊離狀態不發射熒光。而在SYBR非特異性地摻入DNA雙鏈後則發射熒光信號。從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR-Green僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。

SYBR-Green染料法的優勢在於方便快捷，無需探針故成本較低，但是對引物特異性要求較高，檢測靈敏度相對較低。其結果多用於進行相對定量分析。

2 TaqMan探針法：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測係統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

Taq-Man探針法的優勢在於特異性較高，重複性好，但是探針隻能針對一個特定序列，且探針價格較高。這種技術可以用於檢測基因突變檢測進而進行遺傳病篩查，癌症診斷及藥物靶點篩選。結果多用於絕對定量。

1相對定量

分析特定樣品相對於參考樣品某個基因表達量的變化。主要在科研中使用，測量基因表達對各種處理（加藥、造模、基因過表達、RNA幹擾等）的應答。

2絕對定量

使用標準樣品製作標準回歸曲線，利用線性回歸的方法進行絕對定量時，可以基於已知數量對未知數量進行定量。主要在臨床檢測中使用，將病毒拷貝數與疾病狀態建立關聯。並進行基因突變檢測（可用於轉基因食品檢測、遺傳病篩查、癌症早期診斷、靶向藥靶點篩選）。