Western blot原理及實驗流程

一、Western blot原理及應用

WB是一種把電泳分離的蛋白組分從凝膠轉移到一種固相支持物(NC膜或PVDF膜)上，而後采用抗體作為探針進行特定蛋白檢測的技術。

WB主要應用：對細胞或組織提取的蛋白混合物(即總蛋白混合物)中的某一特異蛋白進行鑒別和半定量分析，旨在鑒別特異性蛋白的類型(如亞型、聚體、剪切體等)和蛋白表達量的變化。

依科生物WB服務內容：從蛋白提取開始，進行電泳轉印、封閉、抗體孵育及ECL發光，最終進行基於圖像灰度值的定量分析。

依科生物提供的實驗報告中包括實驗基本流程、蛋白定量原始數據、抗體孵育方式、圖像灰度值分析及曝光原始圖像。

二、Western blot實驗流程

1、樣本製備:蛋白提取、定量及變性。

2、電泳轉印:蛋白SDS-page凝膠電泳後將蛋白轉印至PVDF膜或者NC膜

3、封閉：使用封閉液封閉PVDF膜上未結合蛋白的小孔。

4、抗體孵育：一定條件下使一抗與目標蛋白結合，二抗與一抗結合。

5、發光成像：使用化學發光成像進行條帶顯色。

6數據處理：使用imageJ分析圖像灰度值。

三、實驗結果展示：

四、您需要提供的信息及物質

1、樣本種屬和指標名稱

2、抗體，包括貨號及說明書

3、實驗樣本

未用完的樣本和抗體可以返還

五、樣本收集和運輸

1、組織樣本

收集： 取材應在冰上進行，取材後組織用生理鹽水衝洗幹淨，去除血漬和汙物，並剔除非研究所需的組織；

保存：吸幹水漬並切小塊，放入已標記的凍存管中，液氮速凍後，轉運至-80℃冰箱，可以保存半年左右；

運輸：使用大體積幹冰運輸；

2、細胞樣本

貼壁收集：細胞培養或處理結束後，去除培養液，用預冷的PBS緩衝液快速衝洗細胞以去除培養基，而後加入少量預冷的PBS，使用細胞刮刀將細胞刮下，移於1.5ml離心管中，4℃1500rpm離心去除上清；得到的沉澱為細胞樣本。

懸浮細胞：細胞培養或處理結束後於4℃1500rpm離心去除上清培養基，加入預冷PBS輕柔吹打重懸細胞並轉移至1.5ml離心管中，4℃1500rpm離心去除上清PBS以洗去培養基，洗滌操作需要重複一次。最後離心得到的沉澱為細胞樣本。

保存：液氮速凍後於-80 ℃冰箱中保存，可以保存半年左右。

運輸：使用大體積幹冰運輸；

3、特殊樣本：植物、細菌或者做過特殊處理的樣本需要聯係客服進行溝通。