Werstern blot樣本製備過程

蛋白免疫印跡即Werstern blot ,是將印跡技術與抗原抗體反應的特異性相結合的檢測技術,用於分離和檢測生物標本中的某一特定蛋白。 其基本原理實混合蛋白質樣本通過凝膠電泳分離後,通過特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質(NC膜或PVDF膜)上,將針對待測蛋白的特異性抗體作用於濾膜上,利用抗體上偶聯的酶降解底物在濾膜上生成有色沉澱物或化學發光產物,從而顯示出待測蛋白的存在及量。

樣本製備：

1、樣本的來源:細胞培養上清;細胞(胞漿蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白) ;組織勻漿

2、不同樣本有不同的提取方式:蛋白完全裂解液、RIPA、 胞核/胞漿

3、蛋白的提取: (裂解前加入蛋白酶抑製劑、磷酸酶抑製劑使其終濃度為1mM )

4、蛋白定量: BCA檢測法(靈敏度高,操作簡單,常用)、Bradford 檢測法、Lowry 檢測法、UV測量、電泳檢測

5、樣本上樣前的處理:蛋白提取液和SDS上樣緩衝液( Loading buffer )以一定的比例上樣

6、蛋白變性: 95-100°C變性5分鍾(為了能使抗體接觸到抗原表位,必須將蛋白的三維結構打開,因此需要將蛋白變性,核蛋白要增加裂解液體積和超聲破碎次數,煮樣時間延長至10-15min)