細胞爬片的實驗步驟和注意事項

爬片的準備

1.爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用爬片；

2.將蓋玻片剪裁成合適的大小，以備置於6孔板、12孔板或24孔板；裁剪時用小沙輪輕劃一下，稍用力掰開。如接種大皿，請不要將蓋玻片切開，直接清潔後放入培養皿中，待染色時再切開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做多個指標的染色。

3.將剪裁好的爬片，置於濃硫酸中浸泡過夜，次日用自來水衝20遍，置於無水酒精中浸泡6小時，再用三蒸水衝洗3遍（主要目的是將酸衝洗幹淨，以免影響細胞貼壁效果），置於玻璃培養皿中烘幹後進行高壓消毒。

4.高壓消毒後取出放入烤箱中烤幹，放入超淨台備用。

細胞爬片製作

1.胰酶消化細胞後，計數重懸細胞於完全培養基中。

2.根據玻片的大小加入細胞，向每孔中預留的放置爬片的位置處滴少量培養基，目的是使玻片與培養皿粘合到一起，然後放入玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作。

3.根據需要選擇合適的細胞密度種入培養板內即可

4.待細胞貼壁後，去上清，加含藥培養基。

5.按照實驗設計，一段時間後取出玻片。取玻片時，將注射器針尖向背麵彎曲，將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出。

6.將所需數量的爬片取出時，應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可繼續培養。

細胞爬片的固定

1.細胞爬片取出後，用PBS洗2遍再做固定（此步驟可根據研究目的做取舍，比如做凋亡細胞染色時可免洗，凋亡的細胞在清洗的過程中有可能脫落）。

2.用培養皿保存細胞爬片。在皿底放一層麵巾紙，再放爬片，（方便取片）。然後蓋上蓋子，做好標記，用透明膠帶將蓋子和皿連在一起，-20℃保存。

3.放-20℃保存之前，吸幹培養基或PBS，-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。

以下為常用的固定液（按需選擇）

1.冷丙酮：可用於一般的免疫組化染色。

將純的丙酮預先放入冰箱-20℃後便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會為固體的）細胞爬片取出後，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮於-20℃（丙酮有很強的揮發性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發）固定10分鍾。取出後，室溫吹幹，然後放入-20℃保存。

2.多聚甲醛(常用4%)：可用於免疫電鏡；也可用於免疫熒光以及TUNEL染色。

主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表麵抗原，例如各類淋巴細胞分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。

室溫固定15分鍾後，將表麵液體吹幹，-20℃保存

3. 95％乙醇，可用於免疫組化。

優點：穿透性強、抗原性保存較好。

缺點：但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定後可再溶解；染色過程中，溫育時間膠長，抗原會流失而減弱反應強度。

室溫固定15分鍾後，將表麵液體吹幹，-20℃保存

4. 甲醛(福爾馬林)應用最廣

優點：形態結構保存好，且穿透性強，

缺點：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；分子間交聯形成的網格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。