一、石蠟切片和冰凍切片的比較？
1.要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片。因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。
2.冰凍切片的優點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修複這一步。缺點是細胞內易形成冰晶而破壞細胞結構，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時，目錄上都寫著做什麼樣的切片，如果它寫著隻能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。
3.石蠟切片的優點是可以保持組織細胞的形態結構，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在 -80ºC 的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的切片，為了防止 RNA 降解，保存一貫很重要。由於石蠟切片可以切到 4 μm 左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態都較冰凍切片好。
二、一抗的選擇要點和技巧是什麼？
1.單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合。
另一方麵，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。
在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色（可以通過封閉等避免）。
2.應用範圍的選擇。有的一抗隻能用於 WB ( Western blotting）或免疫組化、免疫熒光、免疫沉澱等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。
3.種屬反應性的選擇。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內的抗原。
4.種屬來源，一般兔來源的多是多克隆；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據此來源來選擇相應的二抗。
三、在什麼情況下使用 Triton-X100？
1.Triton X-100 化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去汙劑。在免疫組織化學(10 μm 以上厚切片) 和免疫細胞化學中一般用 Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。
2.其作用原理：Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。
3.Triton X-100 既是一種表麵活性劑，也有抗氧化作用。
四、封閉血清的選擇原則是什麼？
1.膜上或切片上有剩餘的位點可以非特異性吸附抗體，造成後續結果的假陽性。
2.封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合，否則在後麵的步驟中如果和二抗發生結合，會造成背景。
3.也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。
五、抗體孵育條件的比較？
1.一抗孵育溫度有幾種：4ºC、室溫、37ºC，其中 4ºC 效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般 37ºC 1-2 h，而 4ºC 過夜和從冰箱拿出後 37ºC 複溫 1h。
2.二抗一般室溫或 37ºC 30 min - 1 h，具體時間需要摸索。
六、一抗 4℃ 孵育後為什麼要進行 37℃複溫？
1.一方麵，防止切片從 4ºC 直接放入 PBS 易脫片。
2.另一方麵，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4ºC 和 37ºC 時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小於後者,後者結合更快，但敏感性也提高了並易造成非特異染色。
3.其實，我更讚同後一種說法，因為我嚐試把肝髒或睾丸片子從 4 ℃過夜拿出後，直接用 PBS 洗沒發生過脫片現象。
七、DAB 顯色時間如何把握？
1.DAB 顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控製顯色時間，到出現淺棕色本底時即可衝洗。
2.DAB 顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短抗體孵育時間。
3.若很短時間就出現背景很深，還有可能是你前麵的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間。
4.DAB 顯色時間很長（如超過十幾分鍾）才出現陽性染色，一方麵可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗 4ºC 過夜）；另一方麵就是封閉時間過長。
八、免疫組化結果如何分析？
1.陽性著色細胞計數法。在 40 * 光鏡下，隨機選擇不重疊的 10 個視野，人工或機器計數陽性著色細胞，每組 3-6 張不同動物組織切片，然後進行組間比較即可。
2.灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區域、相同條件下用 image j 進行灰密度分析，然後進行統計分析即可。
3.評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0-3 分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性範圍進行評分（1-4 分為 0-25%、26-50%、51-75%、76-100%），最終可以分數相加，再進行比較。
對於以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質量切片。
九、在什麼情況下進行組織抗原修複，抗原修複的條件是什麼？
1.由於組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修複，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。
2.修複方法從強到弱一般分為三種，高壓修複、微波修複、胰酶修複。修複液也分為若幹種（具體的可以查閱相關資料，酸性的、中性的、堿性的等）。
3.微波修複，我們一般用 6 min * 4 次，效果不錯。
十、內源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什麼？
1.一般 3% 過氧化氫滅活時間短點，可以 10 min 左右；而 0.3% 過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般 10-30 min。
2.用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或 PBS 好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片。
3.現用現配，配好後 4ºC 避光保存。
十一、如何才能充分脫蠟？
1.蠟不溶於水，如果脫蠟不幹淨，少許蠟存留於切片上，將會引起染色不均勻、陽性物時隱時現、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用於脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短；
2.脫蠟的時間要根據季節，室溫和試劑的新鮮謀麵是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5 min 就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20 min 或更長。
3.當天切的切片，燒烤 2 小時後進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫 10-20 min，然後再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果會更好。
總之，操作時應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要徹底、幹淨、完全地脫去切片上的蠟。
十二、如何最大限度地降低組織非特異性染色？
1.縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控製。這是最重要的一條；
2.一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議用單克隆抗體看看；
3.內源性過氧化物酶和生物素在肝髒、腎髒等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；
4.非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；
5.縮短 DAB 孵育時間或降低 DAB 濃度/過氧化氫濃度等；
6.適當增加 PBS 衝洗次數和浸洗時間，在一抗、二抗或 SP 孵育之後的浸洗尤為重要；
7.防止標本染色過程中出現幹片，這容易增強非特異性著色。
十三、蘇木素複染時間的把握？
1.蘇木素複染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數秒-數分鍾。不過這個如果染色不理想可以補救的。即：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置於蘇木素中染色即可。
2.鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子複染完後流水振洗，然後置於鹽酸酒精中數秒（動作一定要快）後拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。
3.如果分化的顏色過淺，可以複置於蘇木素中染色。
十四、PBS 的清洗方式選擇、次數和時間的選擇？
1.單獨衝洗，防止交叉反應造成汙染。
臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完後，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉汙染，影響最後的結果。正確的做法是單獨地進行衝洗，衝洗的 PBS 為一次性，保證切片沒有相互交叉汙染的機會。
2.溫柔衝洗，防止切片的脫落。
衝洗切片，取出切片，將 PBS 從上輕輕地衝洗，讓 PBS 自上而下流下來，不要拿起切片將 PBS 對準切片衝洗，這樣由於衝出的 PBS 有一定的衝擊力，很容易使切片周邊引起鬆動，導致切片的脫落。
3.衝洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
衝洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的衝洗據實踐認為，用一小燒杯柔和地於切片上衝洗，就能徹底衝洗去未結合的物質，無需附加其它條件，衝洗好於切片上再注入 PBS，持續 2 min 左右就完全足夠了。
4.PBS 的 pH 和離子強度的使用和要求。
中性及弱鹼性條件（pH7-8）有利於免疫複合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫複合物的形成，而高離子強度則有利於分解。我們目前常用的 PBS 的 pH 在 7.4-7.6 ，濃度是 0.01 M，根據本室十幾年來的使用情況，認為該溶液價格便宜配製方麵，使用效果好。
5.常用試劑的配製和使用。
在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩衝液，因為切片在整個染色中，抗體的加、換、切片的衝洗，DAB 的配製都離不開緩衝液。可見緩衝液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩衝液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。
十五、脫片產生的原因和如何防止脫片？
1.多聚賴氨酸玻片質量的問題。
2.組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切得厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。
3.組織的問題，我用的組織癌症的很多，越是癌症組織有壞死之類越容易脫。
4.沒烤好，時間短溫度不夠之類。
5.操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。
6.修複的問題：抗原修複的時候高壓時間過長了，或者放進 100ºC 的修複液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用 EDTA 修複比檸檬酸容易脫片，但是你要用到 EDTA 的時候也沒辦法，隻有從另外的問題上著手。
7.此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用 PBS 的時候盡量用泡的，不要衝。基本上把這些方麵都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。
十六、背景染色較深的原因有哪些？
1.抗體濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能隻簡單的按說明書進行染色。
2.抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鍾，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的 1 h，而是 30 min，因此，要根據染色結果進行調整。
3.DAB 變質和顯色時間太長：DAB 最好現用現配，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的 DAB 不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會遊離出氧原子與 DAB 產生反應而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。
DAB 的顯色最好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。
4.組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用組化筆在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
5.切片在緩衝液或修複液中浸泡時間太長（大於 24 h）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修複，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修複液的容器放在 4ºC 冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長。
6.一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
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