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新聞詳情

PCR樣本采集及保存

發布日期:2023/3/23 15:43:00來源://www.bjgszj.com/news926268.html

詳細介紹


一、PCR 實驗中細胞的采集、處理和保存

1.細胞板貼壁細胞收集:

細胞棄培養上清,預冷PBS輕柔洗滌保證完全去除培養基。加少量預冷的PBS用細胞刮刀將細胞收集於凍存管,4℃1500rpm離心去除上清後得到細胞,置於液氮速凍。

2.細胞團塊收集:

細胞團塊加1ml PBS重懸(注意不要過於劇烈造成細胞破裂),4℃ 1000rpm離心5分鍾,棄上清,重複3次,4℃1500rpm離心去除上清後得到細胞,置於液氮速凍。

3.懸浮細胞收集:

將培養完成的細胞,轉移至EP管,1000rpm離心5分鍾,棄上清,4℃1500rpm離心去除上清後得到細胞,置於液氮速凍。

4.細胞收集後的裂解方法:

貼壁細胞去除培養基後直接加trizol,團塊和懸浮細胞在收集到細胞後加適量Trizol重懸(10^6細胞之內加1mlTrizol)。所有細胞樣本在加入裂解液後需要用移液器吹打至無明顯細胞殘渣。

5.保存與運輸

① 收集並液氮速凍的細胞需要保存於-80℃冰箱,可保存1個月。

② 裂解的細胞將細胞放入冰箱凍存(不應反複凍融,否則會使RNA降解),-20℃下,可放置保存1個月; -80℃下,可放置保存6個月;

注:沒有裂解液的情況下需要收集細胞後速凍保存細胞;有裂解液則直接裂解細胞。(Trizol裂解液中含有RNA酶抑製劑,有利於RNA的保存。)

二、PCR 實驗中組織的采集、處理和保存

1、組織收集:取材應在冰上進行,取材後組織用生理鹽水衝洗幹淨,去除血漬和汙物,並剔除非研究所需的組織。取動物的組織,動作要求迅速,盡量避免樣本在環境中暴露太久。

2、組織保存:取材完成後吸幹水漬並切小塊,放入已標記的凍存管中,液氮速凍後,轉運至-80℃冰箱。新鮮的組織可以在-80℃冰箱保存半年左右,3年內凍存組織均可嚐試進行定量PCR實驗;

3、運輸:使用大體積幹冰運輸保證溫度較低。

三、qPCR樣本製備的注意事項

1、樣本量要充足: 足量的並且保證純度的細胞(10^7個)或組織(30mg)

2、取材要速度:取動物的組織,動作要求迅速,盡量避免樣本在環境中暴露太久;

3、保證無菌環境:將組織或細胞迅速放入無菌無酶的凍存管中,為保證質量,推薦選取Axygen,corning,nunc等品牌的凍存管;

4、做好標記:在凍存管上做好標記,盡量清晰易辨;在實驗記錄本上做好記錄,盡量詳細易查;

5、取材完要速凍:可將凍存管直接放入液氮中速凍;或加入1ml Trizol 到凍存管中,再放入液氮速凍;

6、保存溫度及時間:速凍2h 後,將凍存管從液氮轉至-80度冰箱,可以保存6個月左右;

7、PCR的樣本盡早的提取RNA: 盡量及早提取組織或細胞樣本中的RNA並逆轉錄為cDNA,因為即使凍存,降解仍然存在。

8、樣本運輸:液氮或幹冰運輸

9、全血不能放入幹冰中送樣(凍融會使得血細胞裂解),應室溫保存,且采集完全血後,需要盡快處理,從其中分離出所需的淋巴細胞,分離出的淋巴細胞即可按照正常培養的細胞進行處理。


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