β-半乳糖苷酶染色實驗步驟

β-半乳糖甘酶染色實驗原理及步驟

實驗原理 細胞衰老β-半乳糖苷酶染色是一種基於衰老時衰老相關β-半乳糖苷酶活性水平上調而對衰老細胞或組織進行染色。絕大多數正常細胞被認為僅有有限的分裂能力，在不能分裂後就進入衰老(senescence)狀態。此時細胞仍然是存活的，但細胞的基因和蛋白的表達譜發生了很大改變。衰老的細胞不能在一些常規的刺激下再誘導細胞分裂，並且衰老細胞的細胞周期分布也比較特殊，不同於一些損傷誘導的細胞休眠，也不同於細胞生長接觸抑製的情況。衰老細胞通常體積變大，並表達在pH6.0時有高酶活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。細胞衰老也被認為是生物體抑製腫瘤的一種方式，同時也是生物體老化(aging)的一種潛在原因。染色中以X-ga1(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下，半乳糖苷鍵被水解生成深藍色產物，光學顯微鏡下很容易觀察到變成藍色的表達β-半乳糖苷酶的細胞或組織。

β-半乳糖甘酶染色實驗步驟：

（1）細胞爬片：

1.固定：對於6孔板中培養的細胞，吸除細胞培養液，用PBS洗滌1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15分鍾；

2.洗滌： 吸除細胞固定液，用PBS洗滌細胞3次，每次3分鍾；

3.加工作液:每孔加入1毫升染色工作液； 37℃孵育過夜，可以用parafilm或保鮮膜封住6孔板防止蒸發。注意：37℃孵育不能在二氧化碳培養箱中進行；

4.水洗、封片：吸掉工作液，加入70%酒精洗2min，然後用PBS洗3min，甘油封片。

（2）組織切片：

1. 對於冷凍切片，直接按照以下步驟進行。

2. 加入適當體積的β-Gal 固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少於15min。

3. 用 PBS 浸泡洗滌組織3次，每次不少於5min。

4. 按照比例配置染色工作液。吸除β-Gal 清洗液，加入適當量的染色工作液。

5. 37℃孵育過夜。建議使用濕盒或把整個切片浸泡在染色工作液中。

6. 普通光學顯微鏡下觀察。如不能及時觀察，可使用水性明膠封片劑封片保存。

染色結果判讀：衰老細胞呈深藍色。

注意事項：

1. β-Gal 固定液有一定的腐蝕性和毒性，操作時請注意防護。

2. β -半乳糖苷酶染色反應依賴於特定的pH 條件，不能在二氧化碳培養箱中進行染色反應。用於細胞培 養的二氧化碳培養箱中較高濃度的二氧化碳會影響染色工作液的pH 值，而導致染色失敗。

3. X-Gal溶液在-20℃或4℃保存會凍結，37℃恒溫箱或水浴鍋處理2-5分鍾並適當搖動即可完全融解，剛剛溶解時可能觀察到有沉澱，屬正常現象，恢複室溫充分混勻後，沉澱會全部溶解，建議充分混勻後使用。

4. 爬片或塗片如需長期保存可染色後蒸餾水洗2次，傾去多餘液體晾幹後中性樹膠封片。

5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

結果展示：