組織、細胞tunel檢測

一、TUNEL染色實驗原理

實驗原理 TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，並與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結合，後者又與HRP底物二氨基聯苯胺（DAB）反應產生很強的顏色反應（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用於組織樣本（欧宝环球aoa体育平台 、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞塗片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用於抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。

二、石蠟切片TUNEL染色實驗步驟

1.石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ8min-二甲苯Ⅱ8min-無水乙醇Ⅰ 6min-無水乙醇Ⅱ6min-95%酒精 6min-85%酒精 6min-75%酒精 5min-流水衝洗；

2.通透：用20ug/ml的Proteinase K工作液處理組織15min或者細胞爬片加細胞通透液0.3% TritonX-100 15min；

3.漂洗：PBS漂洗2次；每次8min；

4.滅活：0.3%甲醇過氧化氫滅活15min；PBS漂洗2次；每次8min；

5.封閉：5%BSA室溫封閉1h；

6.製備TUNEL反應液：製備TUNEL反應混合液，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液，陽性對照組先加入100μl DNase 1，後麵步驟同處理組。

7.滴加TUNEL反應液：玻片幹後，加50μl TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液）於標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×1h。

8.漂洗：PBS漂洗3次，每次8min；

9.鏡下觀察：可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞（激發光波長為450~500nm，檢測波長為515~565nm）；DAPI複染核，PBS漂洗3次，每次8min；抗熒光淬滅劑封片。

10.(白光tunel）滴加POD:（白光tunel）玻片幹後加50μl converter-POD於標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。

11.漂洗：PBS漂洗3次，每次8min；

12.DAB反應：在組織處加50~100μl DAB底物，鏡下觀察；

13.漂洗：PBS漂洗3次；

14.蘇木素複染：拍照後再用蘇木素複染，幾秒後立即用自來水衝洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

15.拍照時可結合凋亡細胞形態特征來綜合判斷（未染色細胞變小，胞膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體，貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落；而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀/凋亡小體）

對於培養細胞的預處理：

①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸，幹燥後在去離子水中漂洗，幹燥後4℃保存；

②適當方法誘導細胞凋亡，同時設未經誘導的對照組，各組離心收集約1×106個細胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然幹燥，使細胞很好的吸附到載玻片上；

③將吸附細胞的載玻片在4%多聚甲醛中固定25min；

④PBS浸洗二次，每次5min；

⑤將吸附細胞的載玻片在0.3%的Triton X-100中處理5min；

⑥PBS浸洗二次，每次5min；

後續操作如同欧宝环球aoa体育平台 切片的6-15。

三、染色結果判讀：1.白光tunel（加pod）陽性結果棕色；

2.熒光tunel：DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為綠色。

結果展示：